Materiale e dispense

SGARRA Riccardo - METODOLOGIA PER L'USO DEL PROTEOMA
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Metodi per la rilevazione di spot proteici.
Requisiti ideali.
Alta sensibilità.
Colorazione classica.
Colorazione commassie brilliant blue.
Stato colloidale.
Soluzioni vere e proprie.
Dispersioni colloidali.
Argentica convenzionale.
Argentica MS - compatibile.
Comparazione tra CBB e Silver staining.
Colorazione argentica.
Derivatizzazione delle proteine con molecole fluorescenti.
Separazione proteine tramite 2D gels.
Visualizzazione mediante speciali scanner.
Gruppo reattivo: N-idrossisuccinimmide.
Cromatografia.
Molecola d'interesse.
Elettroforesi.
Metodica separativa.
Comatografia liquida.
Gas cromatografia.
Biomolecole.
Colonna cromatografica.
Fase stazionaria, fase mobile.
Interazioni di tipo non covalente.
Legami idrogeno.
Interazioni elettrostatiche.
Forze di Van der Waals.
Interazioni idrofobiche.
Dimensioni delle molecole.
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi.
Coefficiente di distribuzione K.
Cromatografia isocractica.
Cromatografia in gradiente.
Tempo e volume di ritenzione.
Diffuzione trasversale, diffusione longitudinale.
Processi di trasferimento di massa.
Equazione di Van Deemeter.
Relazione tra i parametri e l'altezza del piatto teorico.
Diffusione di Eddy, diffusione longitudinale.
Supporto solido.
Silice monolitica.
Proprietà fisiche, proprietà chimiche.
Supporti di silice derivatizzata e protetta.
Eluizione in gradiente.
Interazione idrofobica e cromatografia.
Cromatografia a scambio ionico.
Scambio aionico, scambio cationico.
Scambiatori forti e deboli.
Cromatofocalizzazione.
Cromatografia d'affinità.
Riconoscimento molecolare.
Cromatografia d'esclusione.
Detector basati sulla spettrofotometria, fluorimetria, spettrometria di massa, variazione dell'indice di rifrazione, elettrochimica.
Determinazione della concentrazione proteica.
Spettrofotometrtia, assorbanza.
Legge di Lambert-Beer.
Metodo diretto.
Metodo di Waddel.
Metodo di Warburg and Christian.
Metodi spettrofotometrici diretti.
Utilizzo diretto dei coefficienti di estinzione molare di W, Y, F.
Metodo di Lowry.
Costruzione di una curva di calibrazione.
Metodo BCA.
Metodo Biuret.
Metodo Bradford.
Cattura di elettroni per dissociazione: metodo diretto.
Trasferimento di elettroni per dissociazione: metodo indiretto.
Processo di frammentazione.
Generazione di reattanza.
Elettroforesi.
Distanza degli elettrodi.
Carica della molecola.
Campo elettrico.
Soluzione tampone.
Legge di Ohm.
Elettroforesi su supporto solido.
Elettroforesi capillare.
Analisi elettroforetica, workflow.
Gel di agarosio.
Polimerizzazione di un gel di poliacrilamide.
Estrazione delle proteine e preparazione del campione.
Metodi di estrazione delle proteine.
Metodi per la quantificazione delle proteine.
Metodi diretti, metodi indiretti.
Preparazione del campione per analisi elettroforettiche.
Perparazione del campione per analisi cromatografiche.
Metodi di prefrazionamento proteico.
Proteomica basata sulle analisi elettroforettiche (bidimensionali.).
Introduzione alla gel elettroforesi.
Elettroforsei SDS-PAGE.
Elettroforesi in condizioni native.
Blu native elettroforesi.
Acido acetico urea.
Isoelettrofocalizzazione (IEF).
Combinazioni bidimensionali (IEF-SDS PAGE).
Metodi di colorazione delle proteine.
Blue coomassie.
Argentica.
DIGE.
Altre colorazioni particolari.
Recupero degli spot bande e loro processamento per analisi MS.
Proteoemica gel free.
Proteoemica shot gun.
Introduzione alla cromatografia e alla strumentazione.
Cromatografia a scambio ionico.
Cromatografia d'affinità.
Cromatografia a fase inversa (RP e ioni pair RP).
Cromatografia d'esclusione.
Spettrometria di massa.
Concetti base della spettrometria di massa.
Metodi di ionizzazione.
Analizzatori di massa.
Quadrupoli, TOF, trappole ioniche, FT-ICR, orbitrap, sistemi ibridi.
Identificazione delle proteine mediante MS.
Cocnetti base della tandem mass spectrometry.
CID: Collision Induced Dissociation.
ETD ed ECD.
Sequenziamento delle proteine mediante MS.
Peptide Mass Fingerprinting.
Cromatografia multidimensionale, SILAC, ICAT, ITRAQ.
Tool bioinformatici per l'identificazione delle proteine.
Approcci proteimici per lo studio di intereazioni proteina-proteina.
Dalla Co-IP alla tandem affinity purification - TAP.
Protein Array.
BRET/FRET.
Surface Plasmon Resonance.